Исследователи из Университета Райса и Медицинского колледжа Бейлора разработали новый метод выделения определенных клеток и в процессе обнаружили более устойчивый флуоресцентный белок.
И платформа, и белок могут быть очень полезны синтетическим биологам и биомедицинским исследователям. Им часто необходимо выделить клетки с определенными визуальными фенотипами, такими как форма или активность, определяемая их генетическим или эпигенетическим составом или историей их развития.
Аспирант Райс Джихван (Джеймс) Ли и Франсуа Сен-Пьер, доцент кафедры нейробиологии Медицинского колледжа Бейлора и адъюнкт-профессор электротехники и компьютерной инженерии в Райс и их команда сообщили о своих результатах в Science Advances .
Ли и его коллеги назвали свою платформу SPOTlight, сокращенно от Single-cell Phenotypic Observation и Tagging with Light. Он устраняет ограничения существующих методов сортировки для выделения единичных живых клеток с уникальными профилями из гетерогенных популяций.
Затем они использовали метод белковой инженерии для разработки самого фотостабильного желтого флуоресцентного белка, о котором сообщалось на сегодняшний день.
«Мы в основном разработали платформу, которая позволяет проверять пространственные и временные свойства отдельных клеток», – сказал Ли, первый автор и студент программы Райса «Системы, синтетическая и физическая биология», работающая в лаборатории Бейлора Сен-Пьера.
«Это делается путем сначала наблюдения за клетками под микроскопом», – сказал он. «Клетки экспрессируют особый белок, так что световое пятно на нужных клетках заставляет их покраснеть. Затем мы можем легко отделить эритроциты от остальных, используя обычное устройство, называемое проточным цитометром».
Этот «особый» фотоактивируемый флуоресцентный белок необратимо переходит из темного состояния в светлый после того, как подвергается воздействию фиолетового света. Фотоактивируемые красители также можно использовать вместо белков. Фактически, ячейки остаются с долговечным тегом.
Чтобы пометить только интересующие клетки, команда использовала цифровое микрозеркальное устройство, массив крошечных зеркал с приводом от двигателя, также используемых в цифровых проекторах, чтобы дать ему возможность освещать отдельные клетки. «Эти микрозеркала вращаются и поворачиваются, чтобы определить область вашего образца, вплоть до отдельных ячеек», – сказал Ли. «Все это автоматизировано. Есть моторизованный столик микроскопа, который перемещает клетки на пластине для визуализации вокруг заранее определенной зоны, а DMD будет светить только на определенную клетку».
С помощью SPOTlight исследователь может наблюдать за популяцией сотен тысяч клеток человека или дрожжей с течением времени, чтобы найти клетки с желаемой клеточной динамикой, субклеточными структурами или формами. Затем можно использовать специальное программное обеспечение для идентификации всех клеток с желаемым профилем и дать указание источнику света и DMD фотоактивировать их фиолетовым светом.
«Затем мы используем проточный цитометр или машину для сортировки клеток, которая может обнаруживать и восстанавливать помеченные нами клетки, а остальные выбрасывать», – сказал Ли. «После того, как мы восстановим интересующие нас клетки, мы можем отправить их на секвенирование или провести дальнейшие исследования».
Ли сказал, что прототип помечает отдельные клетки за 45 секунд до минуты. «Это зависит от мощности света», – сказал он. «С более сильным источником света мы сможем делать это еще быстрее, возможно, до нескольких секунд на ячейку».
Чтобы продемонстрировать полезность SPOTlight, Ли и его коллеги использовали его для скрининга 3 миллионов мутантных клеток, экспрессирующих библиотеку флуоресцентных белков, в конечном итоге идентифицируя и уточняя желтый флуоресцентный белок, который они называют mGold.
«Это вариант существующего флуоресцентного зонда под названием mVenus», – сказал Ли. «Проблема с mVenus заключается в том, что он очень быстро фотообесцвечивается. Он становится все тусклее и тусклее, если вы продолжаете светить на него. Если вы отслеживаете клетки, экспрессирующие mVenus в течение длительного времени, наступает время, когда флуоресцентный белок больше не обнаруживается Поэтому мы решили провести скрининг мутантов mVenus с лучшей флуоресцентной стабильностью ».
Он сказал, что исследователи обычно создают флуоресцентные белки, направляя свет на бактериальные колонии, экспрессирующие эти белки, чтобы увидеть, какой из них самый яркий. С помощью SPOTlight «мы можем одновременно отображать яркость и фотостабильность», – сказал Ли. «Это не то, что обычно делают люди, но биология не статична. Она движется во времени и пространстве, поэтому важно также иметь эти временные свойства.
«По сравнению с обычно используемыми желтыми флуоресцентными белками mGold был в четыре-пять раз более стабильным», – сказал он.
«Важные события развития и поведения требуют мониторинга в течение многих минут, часов или дней, и очень неприятно, когда датчики, которые мы используем для визуализации этих процессов, гаснут, прежде чем мы сможем запечатлеть всю историю», – сказал Сен-Пьер.
«Это как отключение электроэнергии во время просмотра хорошего фильма», – сказал он. «Основываясь на нашей работе с mGold, мы теперь хотим использовать SPOTlight для разработки датчиков, которые позволят нам смотреть полные фильмы.
«Точно так же SPOTlight может позволить синтетическим биологам создавать новые белки, нуклеиновые кислоты или клетки », – сказал Сен-Пьер. «В более широком смысле этот метод может помочь любому исследователю, стремящемуся разгадать генетические или эпигенетические детерминанты интересного клеточного фенотипа, включая такие клинически значимые свойства, как устойчивость к болезни или лечению».
Источник: Университет Райса
Фото: Майк Уильямс, Университет Райса