Секвенирование РНК из отдельных клеток может дать большой объем информации о том, что эти клетки делают в организме. Исследователи из Массачусетского технологического института значительно увеличили объем информации, получаемой от каждой из этих клеток, путем модификации широко используемой техники Seq-Well.
Благодаря новому подходу команда Массачусетского технологического института смогла извлечь в 10 раз больше информации из каждой ячейки образца. Это увеличение должно позволить ученым узнать гораздо больше о генах, которые экспрессируются в каждой клетке, и помочь им обнаружить тонкие, но важные различия между здоровыми и дисфункциональными клетками .
«Стало ясно, что эти технологии обладают преобразующим потенциалом для понимания сложных биологических систем. Если мы посмотрим на ряд различных наборов данных, мы действительно сможем понять ландшафт здоровья и болезней , и это может дать нам информацию о том, какие терапевтические стратегии мы могли бы нанять », — говорит Алекс К. Шалек, доцент химии, один из основных членов Института медицинской инженерии и науки (IMES) и заочный член Института интегративных исследований рака при Массачусетском технологическом институте им. Коха. Он также является членом Института Рэгона при MGH, Массачусетском технологическом институте и Гарварде и членом Института Броуда.
В исследовании, опубликованном на этой неделе в журнале «Иммунитет» , группа исследователей продемонстрировала силу этого метода, проанализировав около 40 000 клеток пациентов с пятью различными кожными заболеваниями. Их анализ иммунных клеток и других типов клеток выявил множество различий между пятью заболеваниями, а также некоторые общие черты.
«Это ни в коем случае не исчерпывающий сборник, но это первый шаг к пониманию спектра воспалительных фенотипов не только внутри иммунных клеток, но и внутри других типов клеток кожи», — говорит Трэвис Хьюз, доктор медицинских наук. студент программы Гарвардского технологического института и медицинских наук и один из ведущих авторов статьи.
Шалек и Дж. Кристофер Лав, профессора химического машиностроения Раймонда А. и Хелен Е. Сен-Лоран и член Института Коха и Института Рэгона, являются старшими авторами исследования. Аспирант Массачусетского технологического института Марк Уодсворт и бывший постдок Тодд Гиран являются соавторами статьи с Хьюзом.
Повторный сбор информации
Несколько лет назад Шалек, Лав и их коллеги разработали метод под названием Seq-Well, который позволяет быстро секвенировать РНК сразу из множества отдельных клеток. Этот метод, как и другие подходы с высокой пропускной способностью, не собирает столько информации на клетку, как некоторые более медленные и более дорогие методы секвенирования РНК. В своем текущем исследовании исследователи намеревались восстановить часть информации, которой не хватало в исходной версии.
«Если вы действительно хотите устранить признаки, позволяющие различать заболевания, вам потребуется более высокий уровень разрешения, чем это было возможно», — говорит Лав. «Если вы думаете о клетках как о пакетах информации, то возможность более точного измерения этой информации дает гораздо лучшее понимание того, на какие популяции клеток вы, возможно, захотите нацеливаться на лечение лекарствами, или, с диагностической точки зрения, за какими из них следует следить».
Чтобы попытаться восстановить эту дополнительную информацию, исследователи сосредоточились на одном этапе, когда они знали, что данные теряются. На этом этапе молекулы кДНК, которые являются копиями транскриптов РНК из каждой клетки, амплифицируются с помощью процесса, называемого полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Эта амплификация необходима для получения достаточного количества копий ДНК для секвенирования. Однако не вся к ДНК амплифицировалась. Чтобы увеличить количество молекул, прошедших этот этап, исследователи изменили способ пометки кДНК второй «праймерной» последовательностью, что упростило ферментам ПЦР амплификацию этих молекул.
Используя эту технику, исследователи показали, что они могут генерировать гораздо больше информации на каждую клетку. Они увидели пятикратное увеличение количества генов, которые можно было обнаружить, и десятикратное увеличение количества транскриптов РНК, восстановленных на клетку. Эта дополнительная информация о важных генах, таких как те, которые кодируют цитокины, рецепторы, обнаруженные на поверхности клеток, и факторы транскрипции, позволяет исследователям идентифицировать тонкие различия между клетками.
«Мы смогли значительно улучшить объем информации на каждую клетку с помощью действительно простого трюка молекулярной биологии, который легко включить в существующий рабочий процесс», — говорит Хьюз.
Сигнатуры болезни
Используя этот метод, исследователи проанализировали 19 биопсий кожи пациентов, представляющих пять различных кожных заболеваний — псориаз, угри, проказу, очаговую алопецию (аутоиммунное заболевание, вызывающее выпадение волос) и кольцевидную гранулему (хроническое дегенеративное заболевание кожи). Они обнаружили некоторое сходство между заболеваниями — например, похожие популяции воспалительных Т-клеток оказались активными как при проказе, так и при кольцевидной гранулеме.
Они также обнаружили некоторые особенности, характерные для конкретного заболевания. В клетках нескольких пациентов с псориазом они обнаружили, что клетки, называемые кератиноцитами, экспрессируют гены, которые позволяют им размножаться и управлять воспалением, наблюдаемым при этом заболевании.
Данные, полученные в этом исследовании, также должны стать ценным ресурсом для других исследователей, которые хотят глубже вникнуть в биологические различия между изученными типами клеток.
«Никогда не знаешь, для чего ты собираешься использовать эти наборы данных, но есть огромная возможность измерить все», — говорит Шалек. «В будущем, когда нам понадобится изменить их назначение и подумать о конкретных поверхностных рецепторах, лигандах, протеазах или других генах, вся эта информация будет у нас под рукой».
По словам исследователей, этот метод также может быть применен ко многим другим заболеваниям и типам клеток. Они начали использовать его для изучения рака и инфекционных заболеваний, таких как туберкулез, малярия, ВИЧ и Эбола, а также используют его для анализа иммунных клеток, участвующих в пищевой аллергии. Они также сделали новую технику доступной для других исследователей, которые хотят использовать ее или адаптировать лежащий в ее основе подход для своих собственных исследований отдельных клеток.
Источник: MIT News
Фото: MIT News