Исследователи из группы Ганса Клеверса в институте Хабрехта разработали новый генетический инструмент для маркировки определенных генов в органоидах человека или мини органах. Они использовали этот новый метод, названный CRISPR-HOT, чтобы исследовать, как делятся гепатоциты и как появляются ненормальные клетки со слишком большим количеством ДНК. Отключив ген рака TP53, они показали, что неструктурированные деления аномальных гепатоцитов встречаются чаще, что может способствовать развитию рака. Их результаты были описаны и опубликованы в научном журнале Nature Cell Biology .
[penci_related_posts title=»Вам также может быть интересно» number=»4″ style=»list» align=»none» displayby=»cat» orderby=»random»]
Органоиды — это мини-органы, которые можно выращивать в лаборатории. Эти мини-органы растут из очень маленького кусочка ткани, и это возможно для различных органов. Способность генетически изменять эти органоиды очень поможет в изучении биологических процессов и моделировании заболеваний. Однако до сих пор получение генетически измененных человеческих органоидов оказалось трудным из-за отсутствия простых методов геномной инженерии.
CRISPR-HOT
Несколько лет назад исследователи обнаружили, что CRISPR / Cas9, который действует как крошечные молекулярные ножницы, может точно разрезать определенное место в ДНК. Эта новая технология очень помогла и упростила генную инженерию. «Маленькая рана в ДНК может активировать два различных механизма восстановления в клетках, которые могут использоваться исследователями для принуждения клеток к захвату новой части ДНК в месте раны», — говорит Далила Хендрикс (Хубрехт). Институт). Считалось, что один из этих методов, называемый негомологичным присоединением конца, часто допускает ошибки и поэтому до сих пор не часто использовался для вставки новых фрагментов ДНК.
«Поскольку некоторые более ранние работы на мышах показали, что новые фрагменты ДНК могут быть вставлены через негомологичное соединение концов, мы решили проверить это на человеческих органоидах», — говорит Бенедетта Артегиани (Hubrecht Institute). Artegiani и Hendriks затем обнаружили, что вставка любого фрагмента ДНК в органоиды человека посредством негомологичного присоединения конца действительно более эффективна и надежна, чем другой метод, который использовался до сих пор. Они назвали свой новый метод CRISPR-HOT.
Красящие клетки
Затем исследователи использовали CRISPR-HOT, чтобы вставить флуоресцентные метки в ДНК органоидов человека таким образом, чтобы эти флуоресцентные метки были прикреплены к определенным генам, которые они хотели изучить. Во-первых, исследователи отметили конкретные типы клеток, которые очень редко встречаются в кишечнике: энтероэндокринные клетки. Эти клетки вырабатывают гормоны, регулирующие, например, уровень глюкозы, потребление пищи и опорожнение желудка. Поскольку эти клетки настолько редки, их трудно изучать. Однако, с CRISPR-HOT, исследователи легко «покрасили» эти клетки в разные цвета, после чего они легко идентифицировали и проанализировали их.
Во-вторых, исследователи нарисовали органоиды, полученные из клеток определенного типа в печени, желчных протоков. Используя CRISPR-HOT, они визуализировали кератины, белки, участвующие в скелете клеток. Теперь, когда они смогли рассмотреть эти кератины подробно и с высоким разрешением, исследователи раскрыли их организацию ультраструктурным способом. Эти кератины также изменяют экспрессию, когда клетки специализируются или дифференцируются. Поэтому исследователи предполагают, что CRISPR-HOT может быть полезен для изучения судьбы и дифференцировки клеток.
Аномальное деление клеток в печени
В печени есть много гепатоцитов, которые содержат в два (или даже больше) раз больше ДНК нормальной клетки. Неясно, как эти клетки формируются и способны ли они делиться из-за этого ненормального количества ДНК. Пожилые люди содержат больше этих патологических гепатоцитов, но неясно, связаны ли они с такими заболеваниями, как рак. Artegiani и Hendriks использовали CRISPR-HOT для маркировки специфических компонентов механизма деления клеток в органоидах гепатоцитов и изучали процесс деления клеток.
Artegiani: «Мы видели, что« нормальные »гепатоциты делятся очень упорядоченно, всегда разделяясь на две дочерние клетки в определенном направлении». Хендрикс: «Мы также обнаружили несколько отделов, в которых образовался ненормальный гепатоцит. Впервые мы увидели, как« нормальный »гепатоцит превращается в ненормальный». В дополнение к этому, исследователи изучили влияние мутации, часто встречающейся при раке печени, в гене TP53, на аномальное деление клеток в гепатоцитах. Без TP53 эти патологические гепатоциты делятся гораздо чаще. Это может быть одним из способов, которыми TP53 способствует развитию рака.
Исследователи полагают, что CRISPR-HOT можно применять ко многим типам человеческих органоидов, для визуализации любого гена или типа клеток, а также для изучения многих вопросов, связанных с развитием и заболеваниями.
Источник:
Институт Хабрехта
Фото: Adobe Stock